CDD：抗精神病药五氟利多靶向DRD2抑制肾细胞癌生长

肾细胞癌（RCC）占肾脏肿瘤的近90%，是全球十大恶性肿瘤之一。根据病理特征，最常见的 RCC 亚型是透明细胞 (cc)RCC，其次是乳头状 (p)RCC [1]。到目前为止，原发性肿瘤的手术治疗仍然是局部 RCC 治疗的金标准。然而，大约 25%~30% 的新诊断患者已经患有转移性肾细胞癌，近 40% 接受手术治疗的患者会出现肾细胞癌复发[2]。 RCC 的高转移指数赋予了对放射和化学疗法的抵抗力，这导致了新的治疗剂的开发，例如基于靶向的疗法。例如，血管内皮生长因子 (VEGF) 靶向酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 索坦 (舒尼替尼) 在治疗 mRCC 方面表现出疗效。大约 70% 的患者对 VEGF TKI 表现出初始反应，但患者最终会获得耐药性，并且随着肿瘤发展出对 VEGF TKI 反应的回避机制，疾病会进展 [3, 4]。因此，靶向转移起始细胞的药物将引起人们的极大兴趣。

RCC 是一类异质性非常高的肿瘤，包括源自肾小管高度异质性上皮的不同肿瘤群 [5]。癌症干细胞 (CSC) 是癌细胞的小亚群，具有驱动肿瘤生长和导致肿瘤异质性的自我更新能力 [6]。除了癌症发展之外，CSC 还导致疾病复发、转移和癌症侵袭性，包括化疗、放疗和靶向治疗等治疗耐药性 [4, 7, 8]。因此，基于调节干细胞特性的分子机制，开发靶向 CSC 的新治疗药物将具有重要意义。

多巴胺是一种主要的儿茶酚胺神经递质，与多巴胺受体（DRs）结合，因此在中枢神经系统（CNS）包括睡眠、工作记忆、情绪、学习等方面发挥着重要作用。多巴胺能系统的功能障碍与精神分裂症和帕金森病 (PD) 有关，而通过拮抗剂靶向 DR 是主要方法 [9]。除了在 CNS 中的作用外，多巴胺-DR 轴还具有调节胃肠动力、心血管功能、免疫系统和肾功能的外周功能 [10-12]。 DRs是G蛋白偶联受体，由DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5组成，根据调节的不同分为D1样受体（DRD1和DRD5）和D2样受体（DRD2、DRD3和DRD4）对腺苷酸环化酶 (AC) 活性的作用 [10]。先前的流行病学研究表明，接受 DR 拮抗剂的精神分裂症或 PD 患者的癌症发病率较低 [13-15]，这表明 DR 拮抗剂可能适合重新用于癌症治疗。实际上，越来越多的证据表明，DRs，尤其是 DRD2，与各种癌症类型中肿瘤行为的调节有关，包括增殖、凋亡、自噬和干性 [16]。例如，据报道，一种 DRD2 抑制剂匹莫齐特可诱导胰腺癌细胞的细胞周期 G1 期阻滞和凋亡 [17]。另一种 DRD2 阻滞剂硫利达嗪被证明可诱导卵巢癌细胞自噬 [18]。三氟拉嗪是一种临床上使用的靶向 DRD2 的抗精神病药物，被证明可以抑制 CSC 的生长并克服肺癌的耐药性 [19]。

五氟利多是一种二苯基丁基哌啶类抗精神病药物，通过靶向 DRD2 治疗精神分裂症时，其消除半衰期比硫利达嗪、三氟拉嗪和匹莫齐特长 [20, 21]。 最近，包括我们实验室的研究在内的一些研究调查了五氟利多对几种癌症类型的抗癌作用，特别是乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌 [20, 22, 23]。 到目前为止，五氟利多对 RCC 的抗癌潜力仍然未知。 此外，之前的研究都没有调查五氟利多的抗癌活性，这是由于 D2 受体拮抗作用。 因此，本研究在体外和肿瘤异种移植模型中研究了五氟利多对 RCC 的抗癌作用，并检查了可能的潜在机制，包括 DRD2。 我们进一步研究了五氟利多治疗是否可以通过根除 RCC CSC 来潜在地抑制 RCC 肿瘤的生长。

结果显示，ccRCC 占所有 RCC 病例的 75%，约 80% 的 ccRCC 病例携带肿瘤抑制基因 VHL [28] 的突变。在这里，我们使用了四种 RCC 细胞系，包括 ccRCC（Caki-1、A498 和 786-O）和 pRCC（ACHN），它们含有野生型（WT）或突变 VHL 基因来评估短期治疗（24 h）指定浓度（0, 1.25, 2.5, 5, 10 和 20μM）的五氟利多对细胞增殖的影响。根据 MTT 测定结果，五氟利多对 Caki-1、A498、786-O 和 ACHN 细胞的细胞活力的半数最大抑制浓度 (IC50) 值分别为 8.42、6.19、7.38 和 6.28 μM （图。​（图1A）.1A）。此外，采用集落形成试验评估五氟利多的长期抗癌作用。用五氟利多处理 ccRCC 细胞（A498 和 786-O）7 天后，这些细胞的集落形成能力均受到五氟利多的浓度依赖性抑制，并且 1 μM 的五氟利多显示出显着的抗集落形成活性（图.​（图1B）.1B）。尽管用 2.5 μM 五氟利多处理 24 小时仍能有效降低 786-O 和 A498 细胞的集落形成能力（图 ​（图 1C）、1C），但我们进一步观察到五氟利多与舒尼替尼联用的增强作用/ sutent，RCC的一线疗法，对ccRCC细胞增殖的抑制作用（图​​（图1D）.1D）。这些结果表明，五氟利多可能可用作治疗 ccRCC 的治疗剂。

鉴于五氟利多对 CSC 表型的抑制作用，随后在 ccRCC 细胞中评估了其对赋予癌细胞自我更新特性的 OCT4 等多能转录因子的影响 [33]。如图4B、4B所示，786-O、A498和Caki-1细胞用五氟利多处理72 h后，OCT4的mRNA表达水平显着降低。 OCT4 保守区域 4 (CR4) 驱动的荧光素酶报告基因活性也通过在 786-O 细胞中以浓度依赖性方式接受五氟利多而受到抑制（图（图 4C）.4C）。除了五氟利多对 OCT4 基因的转录抑制作用外，在用五氟利多处理 A498 ccRCC 细胞 4 小时后，OCT4 蛋白的核定位也被阻断（图（图 4D）.4D）。除 OCT4 外，OCT4 [34] 的下游靶标 Nanog 的 mRNA 表达和核定位也被 ccRCC 细胞中的五氟利多处理抑制（补充图 6）。在临床标本中，与来自 TCGA 和基因型组织表达 (GTEx) 数据集的正常组织相比，在 ccRCC 肿瘤中观察到显着更高的 OCT4 转录物（图 ​（图 4E）.4E）。 Kaplan-Meier (KM) 图显示，与 OCT4 或 Nanog 低表达的患者相比，具有高 OCT4 或 Nanog 表达的 ccRCC 患者的总生存期 (OS) 和疾病特异性生存期 (DSS) 更短（图 4F4F 和补充图 7）此外，从上述相同的 TCGA 数据库中，与 OCT4high/Nanoglow、OCT4low/Nanoglow 或 OCT4low/Nanoglow 肿瘤患者相比，OCT4high/Nanoghigh ccRCC 肿瘤患者的 OS 和 DSS 率最差（图 2）。 (图4G).4G).综合临床数据表明，OCT4和Nanog的上调是促进ccRCC进展的关键事件。五氟利多对ccRCC中CSC特性的负调控可能是通过靶向OCT4和Nanog .

Penfluridol inhibits growth of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) cells via targeting GLI1-mediated expressions of pluripotent transcription factors.

Tumorigenicity in vivo xenograft and limiting dilution assay.

Dopamine receptor D2 (DRD2) is targeted by penfluridol to inhibit growth of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) cells.

五氟利多抗精神分裂症的机制被认为是阻断DR，尤其是DRD2[20]。实际上，与来自 GEO 数据库的 GSE15641 数据集的正常组织相比，在 ccRCC 中观察到显着更高的 DRD2 转录物（图（图 7A）.7A）。我们还观察到 RCC 中 DRD2 的敲低显着降低了细胞增殖和集落形成能力（补充图 9A 和 B）。到目前为止，没有证据表明五氟利多的抗癌活性是由于 DRD2 拮抗作用。在此，我们使用多巴胺与五氟利多竞争与 DRD2 的结合，发现多巴胺和五氟利多联合处理 ccRCC 细胞分别逆转了五氟利多诱导的 CHOP、切割的 PARP 和 LC3-II 的上调以及对 ccRCC 细胞中 OCT4 mRNA 表达的抑制携带WT或突变体VHL（图7B和C）。在功能上，多巴胺分别逆转了五氟利多诱导的各种 ccRCC 细胞系中细胞增殖（图​（图 7D）7D）和集落形成（图​（图 7E）7E）的抑制。因为多巴胺不是 DRD2 特异性激动剂，我们进一步使用选择性 DRD2 激动剂喹吡罗来证实我们的结果并观察到五氟利多诱导的细胞增殖抑制也被 786-O 细胞中的喹吡罗显着逆转（补充图 10 ）。相反，DRD2的消耗进一步增强了五氟利多触发的ER应激、自噬和细胞毒性（补充图9C和D）。这些结果表明，DRD2参与了五氟利多诱导的内质网应激增加、干性抑制和自噬介导的ccRCC细胞凋亡。在来自 TCGA 数据库的 ccRCC 患者中，我们观察到 DRD2 的表达与 GLI1、OCT4 和 Nanog 的表达呈正相关（图​（图 7F）7F）和患者预后不良（图​​（图 7G）。 7G)。综上所述，DRD2 可能是涉及五氟利多在 ccRCC 细胞中的抗癌活性的关键靶点。

最近，在 CSCs 中发现了 DRD2。 例如，用 DRD2 拮抗剂硫利达嗪治疗，通过降低白血病干细胞在形成白血病中的功能来揭示体内抗 CSC 活性 [39]。 在我们目前的研究中，球体形成和异种移植限制稀释测定的结果也表明，五氟利多在 ccRCC 中表现出体外和体内抗 CSC 活性。 加森迈尔等人。 表明 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) + RCC 细胞呈现出 CSC 特征，例如对 TKI 的抗性增加、球体形成能力增强和体内肿瘤生长诱导潜力，并表达高水平的干细胞相关标志物， OCT3/4、Nanog 和 Sox2 [40]。 在此，我们发现五氟利多在各种 ccRCC 细胞中转录抑制 OCT4 和 Nanog 表达并增强对 TKI 舒尼替尼的反应，但 CXCR4 在五氟利多抗 CSC 活性中的作用需要进一步研究。

目前的数据证明了 DRD2 拮抗剂五氟利多在携带 WT 或突变 VHL 的人类 ccRCC 中的新抗癌机制。 五氟利多可触发内质网应激诱导的UPR GRP78/PERK/eIF2α/CHOP信号通路，抑制Akt/GLI1/OCT4/Nanog轴，分别导致自噬和干细胞抑制，进一步诱导ccRCC细胞凋亡

原始出处：

Tung MC, Lin YW, Lee WJ, Wen YC, Liu YC, Chen JQ, Hsiao M, Yang YC, Chien MH.Targeting DRD2 by the antipsychotic drug, penfluridol, retards growth of renal cell carcinoma via inducing stemness inhibition and autophagy-mediated apoptosis.Cell Death Dis. 2022 Apr 23;13(4):400. doi: 10.1038/s41419-022-04828-3