免疫印迹法检测抗核抗体(ANA)谱质控线未出的思考

前 言

免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术[1]。

欧蒙免疫印迹法检测ANA谱的质控带所包被的物质为羊抗人的IgA、IgM、和IgG的多克隆混合抗体。因此，经过完整的实验流程后，质控带均应该出现着色均匀，清晰可见的强阳性反应（软件判读时，着色强度为+++）[2]。

案例经过

患者女，26岁，停经5月，发现牌大1月为主诉入住我院，停经40余天至当地医院彩超检查，提示宫内早孕，停经后未出现明显的早孕反应，间断腹泻，稀水样，未处理，停经4月时自觉胎动，活跃至今，未建立围保，未行NT超声，孕18+周当地县妇保健院行彩超提示“脾大”(未见单)，血常规提示轻度贫血(未见单)，未特殊治疗，唐氏筛查21-三体高风，遂至我院行羊水穿刺检查，结果未回；

1天前我院四纬彩超示：1、宫内妊娠、中孕、单活胎。2、胎盘低置状态3、胎盘内液性暗区(考血池)。4、母体右侧髂窝积液。无痛，无阴道流液、出血、发热等不适，今为求进一步诊治来我院，门诊以“胎盘低置状态、胎盘血池、髂窝积液和母体肝脾增大待查、孕1产0宫内孕22+4周、胎儿21-三体高风险”之诊断收住院。

既往史：平时体差，自幼易感冒、发热。9年前受凉后出现“肺部感染“后出现间断咳嗽，曾先后到多个三甲医院对症治疗，治疗后无明显好转；2年前发现右侧膝关节上方局部肿胀，囊性包块，孕期有所增大，未特殊诊治。

入院体格检查肝肝肋下：3cm，脾肋下：4cm质硬。实验室检查：血常规：白细胞3.02×10^9/L，中性粒细胞计数1.20×10^9/L，红细胞3.33×10^12/L，血红蛋白79.0g/L，网织红细胞百分比2.6%，血小板86×10^9/L三系均出现不同程度的减低；

甲功三项、铜蓝蛋白未见明显异常；传染病四项阴性、甲肝抗体阴性、戊肝抗体阴性，非嗜肝病毒谱全阴性；间接免疫荧光法检测抗核抗体和自免肝抗体谱全阴性；免疫印迹法检测ANA抗体谱实验失败；血型鉴定：正定型凝集、反定型未凝集，基因检测为B型血；

查阅病历，该患者临床诊断为：1、再生障碍性贫血？2、巨脾3、上呼吸道感染4、胎盘低置状态5、孕1产0宫内孕23周6、胎儿21-三体高风险7、阴道炎。

分析免疫印迹法检测ANA抗体谱实验失败（膜条质控线未检出见下图1）的原因，排查实验流程、仪器均未发现任何异常、室内质控均在控，考虑人工加样是否出现漏加样本的原因，重新复合该样本，ANA抗体谱膜条质控线扔未检出。

图1 免疫印迹法检测ANA谱实验结果

根据欧蒙免疫印迹膜条质控线包被的物质为羊抗人IgG、IgM、IgA的多克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的抗人IgG，只要体存在正常量的免疫球蛋白，经过完整的实验流程后，质控带均应出现着色均匀、清洗可见的强阳性反应（软件判读时，灰度值达+++），多次重复此实验质控线均未检出提示患者体内IgG缺乏、血型鉴定：反定型未凝集，提示患者体内IgM缺乏，查阅病历发现该患者自幼肺部感染迁延不愈，经常腹泻、咳嗽，考虑该患者是否为免疫缺陷病导致免疫球蛋白缺乏？

和临床沟通建议医生开具免疫球蛋白+补体的定量测定，本室用罗氏e501免疫比浊法进行第一次免疫球蛋白检测时机器全线报警<0.00，而补体正常，请求技术支持，在工程师的指导下进行5倍浓缩检测，机器依然报警，20倍浓缩检测结果图2示，患者三项免疫球蛋白均出现大幅减低。

图2 免疫球蛋白定量测定结果

多个实验互相验证找到真凶，和临床沟通反馈ANA谱检测结果异常的原因，并及时提醒医生由于患者三种免疫球蛋白的严重缺乏，导致间接免疫荧光法检测患者ANA和自免肝抗体谱IgG抗体时也出现了阴性，但不排除患者是否合并了自身免疫性疾病。鉴于该患者及家属保胎意愿强烈，医生及时进行对症处理，病情稳定患者要求出院。

案例分析

通过免疫印迹法检测ANA谱失败的实验个案，诊断出该孕妇为普通变异型免疫缺陷病。普通变异型免疫缺陷病 （common variable immunodeficiency，CVID）是一种原发性免疫缺陷病，特征为Ｂ细胞分化障碍伴免疫球蛋白生成缺陷，是严重抗体缺乏症中最为常见的疾病类型[3]，其患病率为1/25000～1/5000[4-6]，儿童和成人均可发病。

该病以血清多种免疫球蛋白显着减少，包括血清总IgG浓度减低及低水平IgA和/或IgM，，并发各种机会性感染，临床常表现为反复发热和多部位感染，尤以呼吸道感染和胃肠道感染最为常见。由于免疫功能缺陷， 也易并发肿瘤和自身免疫相关疾病（autoimmune disorders，ＡD）[7]。

普通变异型免疫缺陷病的病因尚不清楚，有报道普通变异型免疫球蛋白缺乏症与多个基因的缺失有关。CVID诊断国内目前尚无统一标准，依据1999年欧洲免疫缺陷病协会和全美免疫病缺陷病协作组的CVID诊断标准[8]：对反复发生感染， 至少一种免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)水平低于相应年龄均值的两个标准差（我国标准为血清免疫球蛋白总量低于3.0g/L，IgG低于2.5g/L）并除外其他可导致低丙种球蛋白血症的原因（括药物、感染、先天性无丙种球蛋白血症、选择性IgA缺乏症等），诊断为CVID。

该病例不仅自幼表现为反复的呼吸道及胃肠道的感染，并出现三种免疫球蛋白的缺乏，均符合诊断标准。该病例是由于免疫印迹法检测ANA谱时质控线未检出，查找原因时发现：试剂、仪器、人员、室内质控等多方分析验证均未发现异常，并对该样本进行再次复核，从LIS系统查看患者其他检测项目发现患者的血型鉴定报告未审核，

当即联系输血科了解到该患者血型鉴定时反定性出现未凝集，从而考虑患者是IgG联合IgM缺乏，积极联系临床并建议医生开具免疫球蛋白的定量测定，再次印证该患者为IgG、IgM、IgA均缺乏的免疫缺陷病，利用各个实验检测原理，通过抽丝剥茧的层层分析，不同实验互相验证，终于找到免疫印迹法检测ANA谱实验质控线未出的线索，并最终验证了我们的判断，该患者是因为免疫球蛋IgG缺乏导致ANA谱实验的失败，并为临床的诊疗提供了有力的证据。

通过这个案例提示我们：实验结果出现不符合逻辑、难以解释的异常时，应该同室内质控失控时一样重视，逐一排查原因；及时临床沟通，通过我们的专业知识判断给予临床合理化的实验室检查建议，尽可能给临床提供可靠的实验数据。

专家点评

高岚 主任技师 河南省省人民医院检验科副主任

本案实验室从对实验失败的疑惑，在积极寻求答案时，为罕见病的诊断提供了有力的证据，并充分利用检验科LIS系统查找不同实验异常的原因，不同的实验相互验证，推导出实验失败的原因，并积极主动和临床沟通，为临床开具实验检查提出合理化建议，也充分发挥了检验医师在临床沟通中的桥梁作用。

参考文献

[1]. 蛋白质免疫印迹（Western Blot）.中华结直肠疾病电子杂志，，2015(4)： 85.

[2]. 王炜玮等，蒙免疫印迹法在实验操作中常见问题处理及结果评价.山西医药杂志，，2015. 44(05)： 第521-523页.

[3]. Agarwal， S. and C. Cunningham-Rundles， Autoimmunity in common variable immunodeficiency. Ann Allergy Asthma Immunol，，2019. 123(5)： p. 454-460.

[4]. Hammarstrom， L.， I. Vorechovsky and D. Webster，，Selective IgA deficiency (SIgAD) and common variable immunodeficiency (CVID). Clin Exp Immunol，，2000. 120(2)： p. 225-31.

[5]. Picard， C.， et al.，，International Union of Immunological Societies： 2017 Primary Immunodeficiency Diseases Committee Report on Inborn Errors of Immunity. J Clin Immunol，，2018. 38(1)： p. 96-128.

[6]. Gathmann， B.， et al.，，Clinical picture and treatment of 2212 patients with common variable immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol，，2014. 134(1)： p. 116-26.

[7]. Wang， J. and C. Cunningham-Rundles， Treatment and outcome of autoimmune hematologic disease in common variable immunodeficiency (CVID). J Autoimmun，，2005. 25(1)： p. 57-62.

[8]. Conley， M.E.， L.D. Notarangelo and A. Etzioni，，Diagnostic criteria for primary immunodeficiencies. Representing PAGID (Pan-American Group for Immunodeficiency) and ESID (European Society for Immunodeficiencies). Clin Immunol，，1999. 93(3)： p. 190-7.