癌症生物学系列：肿瘤与细胞凋亡

1 前言

多细胞动物都能从自身组织中清除有缺陷或失灵的细胞。鉴于这个功能，哺乳动物在它们的细胞内拥有一个忠实的警卫。在几乎哺乳动物所有的细胞中，p53蛋白都承担着这项重要的任务，保证细胞机能有条不紊。

加入p53接收到细胞代谢紊乱或者遗传物质损伤的信息，它将阻止细胞生长分裂循环的进程，并且同时促进细胞损伤修复。如果p53认为代谢紊乱或者基因组的损伤严重到无法修复的程度，则放出信号激活细胞潜在的自杀程序——凋亡。这将导致该细胞迅速死亡，因为如果不清除这样的细胞而任由它继续生长，将对机体的健康和发育造成威胁。

个体中大多数细胞都由凋亡程序控制着，而这些凋亡程序可能是由p53激活的。细胞凋亡过程包括一系列显著的细胞学改变，这个过程能使细胞在1小时内消失的不留任何痕迹。

2 p53的发现

大肿瘤（LT）抗原是SV40病毒产生的具有多种功能的蛋白质，用来扰乱被感染或者转化细胞的调控通路。在与大T抗原的免疫共沉淀物中，还包含一个与其相互作用的蛋白质，分子量约54kDa，这种新发现的能与大T抗原结合的蛋白质被命名为p53。

最初，科学家发现在大鼠胚胎成纤维细胞中共转染p53 cDNA克隆和ras癌基因可以转化这些啮齿类动物的细胞。这说明p53基因可能起着与癌基因myc类似的癌基因的作用。但后来的研究发现事实并非如此，最初的p53 cDNA以肿瘤细胞的mRNA为模板合成，而随后从正常细胞中获得的p53 cDNA并不能使细胞转化，反而抑制了细胞的转化。

在比较了这两种cDNA的序列之后发现，两种之间的区别在于一个碱基的替换——一个点突变，这个点突变导致了p53蛋白中一个氨基酸的改变。因此，最早用于研究克隆编码的一个突变的p53蛋白，其功能也发生了改变。

这些结果显示野生型p53等位基因的实际功能是抑制细胞的增殖，而当其阅读框发生点突变时，p53蛋白就会获得促进细胞生长的功能。鉴于这些发现，p53基因最终被认为是一个抑癌基因。

到了1987年，研究发现p53的等位基因点突变在很多人类肿瘤细胞的基因组中广泛存在。大量研究的综合数据显示，在30%-50%的人类肿瘤中都存在p53基因的突变。 

实际上，在迄今所以人类肿瘤细胞基因组中，p53是发生突变频率最高的基因，在几乎1/3的人类肿瘤中都以突变的形式存在。

3 p53蛋白的突变

p53基因在肿瘤细胞基因组中的变化频率显示，许多初期的肿瘤细胞都必须干扰或者破坏p53的功能才能旺盛生长。那么，这些细胞是如何精确地使p53失活的呢？

研究表明，绝大多数肿瘤相关的突变p53等位基因都在它们的阅读框中存在错义密码子（导致氨基酸改变），而不是无义密码子（导致多肽链终止）。迄今为止，大约超过26000个来自人类肿瘤细胞基因组中的p53等位基因被测序，发现其中大约74%都存在错义突变。另外，p53基因阅读框中的序列缺失相对来说较少见。由此得出一个不容忽视的结论，相比于通过无义突变或者直接删除p53基因从而导致p53功能完全失活，肿瘤细胞在p53蛋白发生轻微改变的情况下获益更大。

突变后能够干扰或者妨碍细胞中那个剩下的野生型拷贝活性的等位基因被命名为显性负等位基因。此外，对p53蛋白的生化化学分析表明p53是一个核蛋白，一般以同源四聚体的形式存在于细胞中。将显性负效应的概念和观察到的这个四聚体形态联系在一起，可以推测出突变的p53等位基因能有效地干扰在同一个细胞中表达并持续起作用的野生型p53等位基因。

假设人类肿瘤细胞中存在一个突变的p53等位基因，编码了一个失去正常功能但仍能形成四聚体的p53蛋白。如果这个突变的等位基因和野生型的等位基因在此细胞中共存，那么这个细胞中的p53四聚体将是包含了突变的p53蛋白及野生型蛋白。在这种杂合子细胞中，只有1/16的p53四聚体可以完全由野生型的p53亚基组成，并具有完整野生型的功能。   

对于初期的肿瘤细胞来说，显性负等位基因的突变显然比缺失此等位基因而导致完全不能编码的p53蛋白要更有利。实际上，在p53基因座突变的大多数人类肿瘤细胞中，都发现了p53基因的杂合性缺失。在这些细胞中，当一个p53基因在开始突变后，接下来剩下的野生型p53基因也会通过杂合性丢失机制被清除。

4 p53的表达调控

早在p53蛋白的DNA结合结构域被发现之前，该蛋白在许多正常细胞或肿瘤细胞的核定位就提示了它可能作为一个转录因子来发挥功能。P53蛋白水平的测定表明在不同类型的细胞中其表达存在着巨大的差别，而且当细胞暴露在某些生理学压力下时，表达会快速提高。

P53蛋白的半衰期很短，大约只有20分钟，这说明p53是一种高度不稳定的蛋白质，在被合成后不久即被降解。在正常情况下，一个细胞会持续地高速率地合成p53分子并且快速降解它们，以达到一个平衡。这样，在细胞的稳定状态中，此蛋白质水平很低。而由于某些生理学信号的刺激，p53蛋白降解被阻断，就会导致细胞内p53蛋白水平快速增加，从而达到对p53蛋白更为迅速的调控。

20世纪90年代早期，发现了很多能诱导p53蛋白水平快速升高的因子，如X射线、紫外线、损伤DNA的化疗药物等。到目前为止，能够促进p53表达水平的刺激因素越来越多，包括缺氧、染色体DNA的去甲基化和核苷酸前体不足等都能刺激p53的积累。这些发现说明存在很多负责监控细胞系统完整性及功能的传感器。           

关于p53功能的研究揭示了许多细胞生理学应激可以导致p53水平的快速上调。累积的p53蛋白受某些转录后修饰的作用，并将引起一系列的反应。细胞生长抑制反应可以是不可逆的或者可逆的。DNA修复蛋白与抗血管生成蛋白都被动员起来，如果p53接收到特殊的警告信号时，它将阻止细胞的增殖，或者启动凋亡程序。

5 p53的降解通路

像许多细胞蛋白一样，p53蛋白是由泛素蛋白酶体系统降解的。由这个系统降解的蛋白质都会首先被多聚泛素链共价标记结合，然后被转运到蛋白酶体中，并在其中被消化称为寡肽。这个过程中最为关键的一步是起始的标记过程。

在正常的、未被搅乱的细胞中，p53的降解是由称为MDM2的蛋白质来调控的。此蛋白将p53作为一个合成后需要立即被泛素化标记且迅速降解的靶点半来识别。MDM2在这里起着癌蛋白的作用，它通过对抗p53并由此抑制细胞进入细胞周期阻滞，以及进入不生长的衰老期或者凋亡程序。 

MDM2蛋白的活性及其水平由其他的正负信号调节。这个信号通路使细胞在激活PI3K通路后，通过Akt/PKB激酶引起MDM2的磷酸化，将MDM2从细胞质中转入核中，并在核中与p53发生作用。同时，促有丝分裂信号通路中，Ras-Raf-MAPK的激活能通过Ets和AP-1转录因子大幅提高mdm2基因的转录，产生高水平mdm2 mRNA及蛋白质。提高的MDM2蛋白水平MDM2蛋白水平通过PI3K-Akt/PKB信号通路增加了磷酸化激活的MDM2。最后，这些效应都导致了p53蛋白水平的降低。

另一个影响MDM2的机制是通过MDM2拮抗物的发现而发现的，即后来被命名为ARF的基因。在野生型啮齿类动物细胞中表达ARF，可以对细胞增殖产生强有力的抑制作用。进一步的研究发现，在野生型细胞中，ARF的表达可以导致p53水平的快速上调。

ARF一方面可以将MDM2隔离在核仁中，另一方面在细胞质中抑制MDM2.一旦将MDM2与p53的相互作用阻断，p53就能逃离MDM2介导的泛素化及降解，并由此在细胞内快速高水平的累积。

6 p53的失活与肿瘤进展

在肿瘤细胞形成的早期阶段，原癌基因常通过不同形式的突变而激活。这种癌基因的激活很容易将细胞置于p53诱导凋亡的危险中。因此，具有这样一个癌基因的细胞如果减弱p53的功能，就能具备更强的生长优势。

在接下来的肿瘤发展过程中，越来越多的肿瘤细胞会面临着缺氧的问题，因为它们缺乏一个足够庞大的血管网络提供给充足的血液供氧。在这种缺氧的情况下，正常细胞通常会死亡，而肿瘤细胞则会生存下来，这是因为它们的祖辈细胞在肿瘤发生的早期阶段就会失活p53基因。

在肿瘤发展的多阶段、多步骤的长期过程中，p53对遗传损伤诱导反应的缺失会允许累积突变高于正常比例的细胞存活下来。这种突变的增多使原癌基因激活和抑癌基因失活相应增多，也会加速前恶性细胞到恶性细胞的演进过程。

丢失了p53功能的初始肿瘤细胞的优势并不仅限于此。依赖p53表达的一个重要的靶基因是TSP-1，即凝血酶敏感素-1。TSP-1是一个在细胞外间隙阻止血管形成的分泌性蛋白。在肿瘤发展的早期阶段，p53缺失导致TSP-1表达的减少，为成簇的肿瘤细胞得到足够的血供解除了一个重要的障碍。

在几乎过半肿瘤中，p53蛋白常因其基因阅读框突变而被破坏。而在剩下的其他肿瘤中，常存在ARF蛋白的丢失或者MDM2蛋白过表达。另外，p53及其拮抗物MDM2的复杂信号网络的缺损也会削弱p53的功能。

总之，整个有机体能因体内众多细胞的p53守护神而得到保护。一旦它们中有些细胞的p53功能缺失，就会使p53缺失的细胞自由通往恶性转化之路，整个机体就会遭受严重的打击。

参考文献：

1. 《The biology of CANCER》second edition. Robert.A Weinberg