【综述】Ras同源基因家族蛋白A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶信号通路调控缺血性卒中的研究进展

摘要:Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)是一种小的鸟苷三磷酸酶蛋白,在缺血性卒中发生发展过程中可激活Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)｡RhoA/ROCK信号通路是缺血性卒中病理过程中的重要调节因子,调控该信号通路已成为促进缺血性卒中后神经细胞恢复和改善脑缺血-再灌注损伤的研究热点,然而目前RhoA/ROCK抑制剂仅有法舒地尔上市,其余仍处于研发或临床试验阶段｡作者对RhoA/ROCK信号通路对缺血性卒中发挥的调控作用及机制进行总结,并对抑制剂及调控药物的应用进行阐述,旨在为缺血性卒中防治提供新的思路｡

缺血性卒中可在世界范围内造成严重健康和经济负担,发病率呈逐年升高趋势,预计2030年患病率可达到89.32/10万｡缺血性卒中由大脑主要动脉的严重狭窄或闭塞引发,脑血流中断导致神经细胞中氧葡萄糖剥夺是造成中枢神经系统不可逆损伤的关键｡严重的脑缺血可直接引起急性脑损伤,迟发性神经细胞损伤则主要由脑水肿导致,二者作为缺血性卒中发生发展的连续性病理改变,是导致神经炎症级联反应､神经细胞骨架动力学改变的重要因素,进而引发神经细胞死亡､血管完整性受损和继发性脑损伤等不良结局｡

Ras同源基因家族蛋白A (Ras homolog gene family member A,  RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho - associated coiled - coil  forming protein kinase,ROCK)信号通路是缺血性卒中病理过程中的重要调节因子,其中RhoA是Rho家族的小的鸟苷三磷酸(guanosine  triphosphate, GTP)酶,可介导细胞间黏附和细胞骨架动力学,是细胞迁移､增殖､分化和存活的关键调控因子｡ROCK是RhoA重要的下游效应因子,包括ROCK1和ROCK2两种亚型,大脑和脊髓中以ROCK2大量表达为主,在轴突生长的抑制信号和调节细胞存活中起着重要作用｡研究显示,RhoA/ROCK信号通路的激活和上调可在缺血性卒中后的神经炎症､血-脑屏障功能障碍､神经细胞凋亡､星形胶质细胞增生和轴突损伤中发挥有害作用,而抑制和下调该通路可有效改善神经炎症和促进神经细胞生长锥运动,从而诱导缺血性卒中后神经细胞恢复｡当前抑制RhoA/ROCK信号通路的方法主要以抑制ROCK活性为主,RhoA抑制剂较少应用于神经系统疾病,ROCK抑制剂代表药物包括法舒地尔､Y-27632等,但由于ROCK广泛分布于人体各个组织,下游效应物众多,因此缺乏特异选择性｡本文对缺血性卒中发生发展过程中,RhoA/ROCK信号通路参与的调控和介导作用机制进行梳理,并对当前该信号通路的抑制剂应用和药物研发现状作一综述,以期为缺血性卒中防治提供新的思路｡

1 RhoA/ROCK信号通路在中枢神经系统的生理作用

1.1 RhoA

Rho GTP酶具有多种生理功能,包括细胞骨架调节､细胞极性建立及细胞增殖､转录和活性氧产生等诸多方面,可在无活性鸟苷二磷酸束缚态和活性GTP束缚态的循环转化中充当鸟嘌呤核苷酸依赖性分子开关,这是多种效应蛋白或靶蛋白启动下游信号级联的关键途径之一｡RhoA作为Rho GTP酶家族20个成员之一,由193个氨基酸组成,是肌动球蛋白收缩性的驱动因素,可通过对下游效应器ROCK激酶的激活达到肌动蛋白的聚合与迁移后缩作用｡研究显示,RhoA及其效应蛋白在中枢神经系统中高度表达,在神经细胞生长锥动力学､树突棘形成以及轴突延伸和导向等方面扮演重要角色,具有诱导轴突和树突回缩以及脊柱和突触丢失等作用｡此外,Cappello等研究结果显示,RhoA缺失可诱导放射状胶质细胞骨架分解,从而导致神经细胞迁移缺陷｡星形胶质细胞RhoA能激活Yes-激活蛋白(Yes-associated  protein,YAP),通过不依赖于微管的肌球蛋白Ⅱ来限制损伤诱导的星形胶质细胞增生,从而防止星形胶质细胞在中枢损伤后过度反应｡

1.2 ROCK

ROCK属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,在结构上由一个N-末端激酶结构域和一个含有Rho结合结构域的卷曲螺旋域组成,最早被认为是RhoA的下游靶标｡在非激活状态下,ROCK的普列克底物蛋白同源结构域与卷曲螺旋域折叠回到N-末端激酶结构域,形成“自动抑制环”,使其在基础条件下处于活性抑制状态,RhoA与卷曲螺旋域的结合可使得“自动抑制环”打开,暴露ROCK激酶结构域使之激活｡ROCK具有调控细胞骨架的作用,主要通过磷酸化其下游蛋白如肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)､单丝氨酸蛋白激酶等来介导细胞骨架稳定和重排｡虽然ROCK的两种亚型ROCK1和ROCK2高度同源但组织分布不同,中枢神经系统中主要为ROCK2大量表达,广泛分布在海马锥体神经细胞､大脑皮质和小脑浦肯野细胞等｡就结构上而言,ROCK1和ROCK2具有64%的整体同源性,激酶结构域上的同源性高达92%,提示ROCK下游蛋白相同基序可能性大,缺少一定特异性｡

1.3 RhoA/ROCK信号通路的生物学特性

RhoA/ROCK信号通路的生物学特性主要体现在调控细胞骨架､激活下游炎症反应和血管内皮损伤等方面,对神经细胞的修复､存活具有重要意义｡一是当RhoA从束缚态GTP转换成活动态鸟苷二磷酸时,激活的ROCK直接作用于下游调控细胞骨架相关蛋白,导致细胞骨架动力学紊乱,具体可体现在调控轴突生长､内皮细胞排列､血管平滑肌收缩等方面;二是RhoA/ROCK信号通路激活不仅可使核转录因子κB(nuclea rfactor kappa-B, NF-κB)从细胞质向细胞核移动,诱导产生大量炎症因子,且在缺血和炎症双重刺激下,神经细胞同样被激活,共同形成了复杂的神经炎症级联反应;三是RhoA/ROCK信号通路激活可通过促进活性氧生成､下调一氧化氮合酶等途径造成血管内皮损伤和血管痉挛,导致脑血流受限和血栓形成｡

2 RhoA/ROCK信号通路对缺血性卒中的调控机制

RhoA/ROCK信号通路可在缺血性卒中过程中被激活,呈现高表达状态,作用机制多样而复杂,包括神经炎症､轴突生长抑制､血-脑屏障损伤､局灶性脑血流量减低和血小板活化等｡

2.1 RhoA/ROCK信号通路与神经炎症

缺血性卒中诱导的RhoA/ROCK信号通路激活可导致神经炎症的发生,产生过量细胞炎症因子,主要与RhoA/ROCK/NF-κB通路密切相关｡以NF-κB为代表的诱导型转录因子家族,在炎症过程中可发挥调节和激活炎症的重要作用,产生如白细胞介素(IL)-8､肿瘤坏死因子α(TNF-α)､诱导型一氧化氮合酶､单核细胞趋化蛋白1等因子｡研究表明,RhoA/ROCK信号通路在神经和血管炎症中的作用与激活下游NF-κB密切相关,NF-κB还参与了ROCK对神经可塑性和神经细胞存活的影响,可能与NF-κB抑制蛋白的激活有关,通过应用ROCK抑制剂,可以阻断NF-κB前体p65核易位,减少NF-κB抑制蛋白降解,从而抑制NF-κB表达｡神经胶质细胞同样参与了缺血性卒中后的神经炎症反应,NF-κB核转位促进了小胶质细胞极化,小胶质细胞识别并响应神经细胞损伤和缺血性应激,从而加重脑损伤｡Irie等研究显示,通过诱导卒中后受损纹状体的小胶质细胞靶向表达神经源性转录因子,使其转化为诱导神经细胞,可弥补卒中带来的神经细胞功能缺损,从而改善神经炎症,有利于卒中后神经功能的恢复｡同时,RhoA/ROCK信号通路介导的NF-κB激活和核转位上调,可使一些星形胶质细胞转化为具有神经毒性的补体成分3阳性星形胶质细胞,诱导缺血性卒中的神经细胞损伤｡有体外实验显示,与TNF-α处理的星形胶质细胞相比,经ROCK抑制剂Y-27632处理的星形胶质细胞中补体成分3阳性星形胶质细胞数量明显减少(P<0.01),提示ROCK抑制剂Y-27632可抑制星形胶质细胞表型转化｡

2.2 RhoA/ROCK信号通路与轴突生长

抑制

RhoA/ROCK的上调可激活缺血性卒中后对神经细胞恢复功能的抑制,RhoA的表达及活性升高可引起细胞骨架动力学紊乱,通过抑制肌动球蛋白收缩和加速肌动蛋白聚合等途径,诱导轴突生长抑制和生长锥塌陷｡缺血性卒中发生后,具有抑制轴突再生作用的髓磷脂相关抑制剂———Nogo-A､髓鞘相关糖蛋白､少突胶质细胞髓鞘糖蛋白等,与Nogo受体结合,从而激活下游RhoA/ROCK信号通路。ROCK被RhoA活化后,进一步直接或间接磷酸化单丝氨酸蛋白激酶､MLC､二氢嘧啶酶样蛋白2､含表皮生长因子样模块黏蛋白样激素受体等具有调控肌动蛋白､肌球蛋白以及细胞之间形成黏附复合物作用的下游底物蛋白,这种途径被证实在缺血性卒中后细胞骨架重排中扮演重要角色｡此外,正常星形胶质细胞转化为反应性星形胶质细胞时释放的硫酸软骨素蛋白聚糖可阻碍受损神经细胞轴突再生,同时能与Nogo受体相互作用,通过激活RhoA/ROCK信号通路共同诱导轴突生长锥的塌陷｡有研究表明,通过应用RhoA/ROCK抑制剂可以阻断缺血性卒中后轴突生长抑制状态,并在缺血性卒中后神经损伤小鼠模型中得到验证｡

2.3 RhoA/ROCK信号通路与血-脑屏障损伤

血-脑屏障是中枢神经系统的主要防御系统,主要由血管内皮细胞､周细胞､星形胶质细胞､基底膜和细胞外基质组成｡缺血性卒中发生后,血-脑屏障通透性增高,通常不能穿透毛细血管的大分子及有毒物质得以进入中枢神经系统,导致继发性脑水肿和出血性转化等并发症｡一是RhoA/ROCK信号通路的激活,介导了经典MLC磷酸化途径,ROCK磷酸化和MLC磷酸酶失活导致MLC磷酸化和激活,促进了肌动蛋白聚合和F肌动蛋白应力纤维形成,导致血管内皮细胞收缩,细胞旁通透性增加;二是缺血性卒中导致RhoA/ROCK信号通路激活后,构成血-脑屏障的紧密连接结构的分布随之改变｡其中,生理状态下胞质外跨膜蛋白包括occludin､ZO-1､Claudin-5等以连续模式分布在细胞膜表面,在血管内皮细胞收缩影响下可发生丢失及重新分布,在血管内皮细胞上的定位也随之改变｡同时,缺血性卒中导致的RhoA/ROCK信号通路可介导NF-κB激活,NF-κB参与复杂炎症反应可产生大量炎症因子,从而导致免疫细胞浸润中枢神经系统,成为导致血-脑屏障损伤的重要间接原因｡Yamamoto等研究显示,ROCK的激活可促使紧密连接蛋白occludin两个点位(T382､S507)和Claudin-5一个点位(T207)直接磷酸化,从而导致血-脑屏障的紧密连接性降低;三是缺血性卒中也影响了血-脑屏障中星形胶质细胞和周细胞的功能｡有研究表明,RhoA/ROCK/NF-κB通路的激活可诱导血-脑屏障的周细胞分泌基质金属蛋白酶9(MMP-9),通过MMP-9对紧密连接蛋白的降解作用,下调紧密连接蛋白分布水平也是血-脑屏障通透性改变的重要原因｡另外,缺血性卒中可导致星形胶质细胞分化为A1型和A2型星形胶质细胞,其中A1型星形胶质细胞形成的不致密的胶质瘢痕可阻碍血-脑屏障损伤修复,然而A2型星形胶质细胞的分化和增殖却与血-脑屏障修复密切相关,作为神经保护性细胞在血-脑屏障重建中扮演重要角色。Ding等研究显示,抑制RhoA/ROCK信号通路可有效抑制A1型星形胶质细胞增殖,并具有促进星形胶质细胞向A2型转化的作用｡

2.4 RhoA/ROCK信号通路与局灶性脑血流量减低

有研究对内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)敲除的大脑中动脉闭塞小鼠脑组织损伤情况进行了观察,结果显示,与野生型小鼠相比,eNOS敲除小鼠脑血流量明显减少,梗死灶面积增加(均P<0.01),表明eNOS在缺血性卒中脑血流调控中可能发挥维持血流作用｡研究显示,激活缺血性卒中后小鼠RhoA/ROCK信号通路后,eNOS转录出现下调,负性调节eNOS的磷酸化,抑制急性缺血后大脑皮质的血管舒张,从而降低局部脑血流量｡同时,作为脑组织缺血后血管新生及内皮祖细胞募集过程中不可或缺的物质,eNOS能够调控脑源性神经营养因子的表达,从而诱导大脑血管新生,增强缺血性卒中后神经血管恢复作用,然而ROCK抑制剂被证实具有增加eNOS信使核糖核酸半衰期和上调内皮细胞中的eNOS表达的重要作用｡另外,缺血缺氧导致的周细胞张力改变同样是引起卒中后脑毛细血管阻力增加､局部脑血流下降的重要原因,这可能与周细胞胞质中Ca2+浓度上升有关｡RhoA/ROCK信号通路的激活可通过Ca2+敏化作用参与心脑血管的收缩病理过程,而应用ROCK抑制剂法舒地尔可抑制储备Ca2+释放,从而改善缺血缺氧带来的Ca2+超载状态｡大脑中动脉闭塞小鼠模型也表明,应用ROCK抑制剂对缺血性卒中导致的脑血流量减低具有保护作用,野生型小鼠的脑梗死面积较eNOS敲除小鼠减少33%[(56.6 ± 4.9)mm3比(83.7±5.7)mm3],神经功能缺损评分改善37%[(1.2±0.3)分比(1.9±0.3)分;均P<0.05]｡

2.5 RhoA/ROCK信号通路与血小板活

化

血小板活化是止血的重要生理过程,也是多数急性血管闭塞性及缺血缺氧性疾病中血栓形成的关键病理过程｡正常生理情况下,RhoA/ROCK信号通路为巨核细胞有丝分裂､血小板形成和释放的重要调节因子,同时参与了血小板细胞骨架重组,RhoA可以通过ROCK的介导改变血小板的形状｡在缺血性卒中过程中,RhoA/ROCK信号通路可以介导p47phox磷酸化触发活性氧产生,随即产生的各种超氧化物可促进血小板活化和聚集,从而增加了缺血性卒中血栓形成的风险｡然而,RhoA/ROCK信号通路与活性氧存在双向正反馈环,即活性氧也可直接逆向激活RhoA,共同诱导了血小板活化的病理过程｡有研究构建了缺血性卒中的血栓-栓塞小鼠模型,与对照组小鼠(血小板因子4-cre转基因小鼠)相比,将血小板特异性ROCK2缺陷型小鼠血凝块注射至对照组小鼠的大脑中动脉后,其脑血流恢复速度更快,神经功能缺损评分也更低[(1.80±0.24)分比(2.60±0.24)分,均P<0.05],提示ROCK2参与了血小板活化过程,RhoA/ROCK通路上调对于血栓的形成和稳定至关重要｡Iida等通过体外实验探究了RhoA/ROCK信号通路抑制剂对血小板聚集活化的影响,结果显示,Y-27632和法舒地尔均可通过抑制血小板衍生生长因子AB分泌和可溶性CD40配体释放来减少血栓的形成｡

3 RhoA/ROCK信号通路的调控与缺血性卒中治疗

3.1 RhoA/ROCK信号通路抑制剂应用

在缺血性卒中的治疗中,应用ROCK抑制剂来降低其活性,是调控RhoA/ROCK信号通路的重要方法｡由于ROCK两种亚型ROCK1和ROCK2具有高度同源性的结构域,因此目前许多研究以靶向对接ROCK的腺苷三磷酸依赖激酶结构域为目的,广泛应用非选择性ROCK抑制剂,代表抑制剂包括法舒地尔和Y-27632｡然而受非选择性作用影响,ROCK抑制剂不仅可抑制众多下游底物,在较高浓度时也可抑制其他丝氨酸/苏氨酸激酶,如蛋白激酶A和蛋白激酶C｡法舒地尔是目前唯一被正式批准应用于临床脑血管病的ROCK抑制剂,主治脑缺血及蛛网膜下腔出血导致的血管痉挛,上市后监测未见严重的不良反应｡

目前,关于脑血管病治疗的ROCK抑制剂正在积极地探索中,研究方向以ROCK1和ROCK2的选择性抑制剂研发为主,其中ROCK2小分子抑制剂KD025在急性局灶性脑缺血小鼠模型的神经保护实验中,体现出较好有效性和安全性,提示抑制ROCK2途径可能成为治疗缺血性卒中的新思路,具有较好研究前景｡NRL-1049作为新型小分子ROCK2抑制剂被证实在包括大脑中动脉闭塞在内的急性脑损伤小鼠模型中具有保护血-脑屏障的作用,且NRL-1049对ROCK2的半抑制浓度比ROCK1低44倍(0.59μm比26μm,P<0.01),并在生理腺苷三磷酸浓度下对蛋白激酶A和蛋白激酶C无抑制作用,然而NRL-1049对缺血性卒中后血-脑屏障相关调控机制仍有待进一步研究｡

3.2 RhoA/ROCK信号通路的药物调控

缺血性卒中后针对RhoA/ROCK信号通路的药物调控以他汀类药物的应用为主｡研究表明,他汀类药物的多效性(非胆固醇效用)与RhoA/ROCK信号通路具有密切联系,其机制为在胆固醇生物合成过程中可通过减少法尼基焦磷酸的产生来强力抑制Rho家族的GTP酶异戊烯化的作用,调控了其介导的细胞骨架重排､eNOS上调等,从而对缺血性卒中后RhoA/ROCK信号通路的激活具有抑制作用｡目前,他汀类药物与ROCK抑制剂的联合应用也成为协同治疗脑血管病的重点研究方向,然而其多效性在缺血性卒中当中发挥的作用仍有待深入挖掘｡许多其他药物也可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路达到治疗缺血性卒中的目的,包括含氮双膦酸盐､钙通道阻滞剂､肾素-血管紧张素系统调节药物等｡

4 小结与展望

RhoA/ROCK信号通路与缺血性卒中的发生发展存在密切联系,在缺血缺氧后脑组织的损伤和修复过程中参与了复杂调控,目前抑制RhoA/ROCK信号通路已成为治疗缺血性卒中的有效策略｡近年来,深入探索ROCK1和ROCK2在缺血性卒中当中的调控机制与联系,并以此研发特异选择性ROCK抑制剂,已成为RhoA/ROCK途径治疗缺血性卒中的研究重点,这可能为缺血性卒中患者获取更精确的治疗窗提供新的思路｡