IVD技术丨CRISPR方法用于液体活检中的miRNA定量检测

简单、灵敏、准确的核酸检测在早期癌症诊断和传染病检测中起着至关重要的作用。尽管基于PCR的核酸检测方法因其高灵敏度和特异性而被视为金标准方法，但人们对开发替代检测方法的兴趣日益浓厚，以应对诸如对快速、经济高效和易于使用的诊断工具的需求等挑战。其中一种选择是CRISPR-Cas系统。迄今为止，已经开发了各种基于CRISPR的方法，但大多依赖于单独的预扩增，缺乏定量检测能力，限制了其实际应用。

近日，一组来自康涅狄格大学健康中心的研究团队在杂志Nature Communications上发表了一篇题为“Asymmetric CRISPR enabling cascade signal amplification for nucleic acid detection by competitive crRNA”的文章。作者研究了全长crRNA和split crRNA之间的竞争反应诱导Cas12a的不对称反式切割活性，并开发了一种用于核酸检测的级联信号扩增方法，称为不对称CRISPR试验。作者证明，这种竞争性CRISPR反应引起了CRISPR酶的构象重置，可以显著提高CRISPR- cas12a的检测灵敏度，而无需额外的DNA扩增步骤。此外，作者发现Cas12a可以识别片段化的RNA/DNA靶标，从而可以直接检测RNA。基于这些发现，作者应用非对称CRISPR分析定量检测液体活检中的microRNA (miRNA)生物标志物，证明了不对称CRISPR试验可以实现对miRNA的高灵敏度检测，从而显示出作为一种简单、快速、高灵敏度的基于核酸的分子诊断的强大工具的潜力。

图片来源：Nature Communications

主要内容

非对称CRISPR测定概述

下图展示了非对称CRISPR级联信号扩增检测核酸靶点的工作原理。非对称CRISPR测定使用两组竞争性crRNA: i)靶向性全长crRNA和ii)独立的split crRNA。split crRNA由一个单独的5 '支架和一个3 '间隔组成。split crRNA被设计为特异性地结合其自身独立的ssDNA (split- T)，其序列与靶核酸不同。

在不对称CRISPR实验中，当两种crRNA和split- T混合时，由于与split crRNA相比，全长crRNA对Cas12a的结合亲和力更强，因此形成Cas12a/全长crRNA复合物，抑制了split crRNA与Cas12a的结合，即使在split- T存在的情况下，CRISPR-Cas12a也不能被激活(下图b)。在靶核酸存在的情况下，Cas12a/全长crRNA复合物被特异性激活并启动第一次反式切割反应。随后，split crRNA取代全长的crRNA，并重新激活Cas12a进行第二次反式切割反应，从而导致额外的荧光信号扩增。因此，非对称CRISPR检测通过单个CRISPR- cas12a在单管中提供了简单、快速、高灵敏度的核酸检测。

非对称CRISPR法核酸检测示意图。

图片来源：Nature Communications

全长crRNA和split crRNA的竞争性CRISPR反应

为了研究不同crRNA与CRISPR-Cas12a的结合亲和力，作者设计了一种靶向性的全尺寸crRNA和一种split crRNA，它们特异性地结合到DNA靶标的同一区域，以及两个竞争性全长crRNA和split crRNA，结合的目标序列与前述不同 (下图a)。

作者比较了靶向性split crRNA和全长crRNA在不同浓度竞争性全长crRNA下的反式切割活性。结果表明，随着竞争性全长crRNA浓度的增加，靶向性split crRNA的反式切割活性显著降低。相比之下，靶向性全长crRNA的反式切割反应不受显著影响。竞争性split crRNA对靶向性全长crRNA或靶向性split crRNA的反式切割反应均没有显著抑制(下图b)。这些结果表明全长crRNA比split crRNA对Cas12a具有更强的结合亲和力。电泳迁移试验结果也表明，全长crRNA由于具有更强的结合亲和力，可以调节split crRNA与Cas12a结合，并产生竞争性CRISPR反应（下图c）。

全长crRNA和split crRNA之间的竞争性CRISPR反应。

图片来源：Nature Communications

竞争性crRNA级联信号放大

利用全长crRNA与split crRNA对Cas12a亲和力的差异，作者探索了通过CRISPR-Cas12a构象再激活进行高灵敏度核酸检测的级联信号扩增机制。结果证实，无论split crRNA是否存在，全长crRNA都可以发生靶标切割；然而，全长crRNA会抑制split crRNA的切割反应 (下图a)。这些结果表明，在两者存在的情况下，全长crRNA反应比split crRNA反应更优先发生。

根据实验结果和文献，作者假设全长crRNA激活 CRISPR-Cas12a切割反应后，split crRNA可以取代全长crRNA并与Cas12a结合，从而实现CRISPR的级联信号扩增反应。如下图c所示，没有靶标的情况下，即使增加split crRNA的浓度，全长crRNA仍然与Cas12a结合，不能被split crRNA取代。但当加入全长crRNA的靶核酸full-T时，Cas12a被激活，触发与全长crRNA的第一次反式切割反应。然后，split crRNA可以取代全长crRNA，与Cas12a结合，通过其split-T重新激活Cas12a，诱导第二次反式切割反应，导致级联信号放大。

竞争crRNA检测核酸的级联信号放大。

图片来源：Nature Communications

利用片段化RNA/DNA靶标进行Cas12a RNA检测

为了通过CRISPR-Cas12a直接检测RNA，作者使用了两个片段化的核酸靶点，它们特异性地结合crRNA，并释放Cas12a的反式DNA切割活性(下图a)。结果显示，当只有ssDNA-activator或ssRNA/ssDNA-target存在时，反式切割活性不能发生。ssDNA 5 ' -activator /ssDNA 3 ' -target和ssRNA 5 '-target/ssDNA 3 ' -activator能够诱导Cas12a旁切活性，而ssDNA 5 ' -activator/ssRNA 3 '-target则不能。因此，ssRNA与crRNA的结合位置高度影响Cas12a的反式切割活性((图b-d)。

利用片段化RNA/DNA靶标进行Cas12a RNA检测。

图片来源：Nature Communications

无扩增miRNA定量检测

接下来，作者研究了是否可以通过非对称CRISPR检测进一步提高Cas12a的miRNA检测灵敏度，实现无扩增miRNA检测。作者设计了ssDNA 3 ' -activator，同时可以作为split crRNA靶标。还设计了一个split crRNA来识别部分DNA activator，以及一个同时结合miRNA和DNA activator的全长crRNA。结果显示，在不对称CRISPR实验中，在低浓度靶条件下，比如1 pM靶miRNA的终点荧光信号差异比无split crRNA时高29.2倍(下图f)。

如图g所示，加入split crRNA后，检测灵敏度较未加入split crRNA的情况有明显提高。随着miR-19a浓度从1 fM到10 pM，荧光强度线性增加。通过非对称CRISPR检测，可以获得miR-19a的LOD为856 aM，这比无split crRNA的CRISPR检测灵敏度高1000倍。因此，非对称CRISPR方法为无扩增、定量检测miRNA提供了一种简单、高灵敏度和特异性的方法。

不对称CRISPR法定量检测miRNA。

图片来源：Nature Communications

非对称CRISPR检测的临床验证

最后，作者探讨了不对称CRISPR检测在miRNA液体活检中癌症诊断和预后的潜在效用，使用非对称CRISPR技术分析了膀胱癌患者血浆样本中miR-19a的表达水平(下图a)。

首先使用商用RNA提取试剂盒从10名膀胱癌患者和5名健康供体的血浆样本中提取总RNA，并与含有Cas12a/crRNA和split crRNA的反应溶液混合，实时测量荧光信号，计算每个血浆样品中靶miR-19a的浓度。结果证实了膀胱患者样本中miR-19a的总体表达水平高于健康供体样本(图b和d)，且此方法与RT-qPCR的结果具有良好的相关性。这些临床检测结果表明，非对称CRISPR方法可以简单、快速、无扩增地检测临床样品中的miRNA，灵敏度高，为其临床应用提供了经验支持。

不对称CRISPR检测临床样品中无扩增miRNA的临床应用。

图片来源：Nature Communications

总结与讨论

这项研究中有两个主要的CRISPR发现:(i)全长crRNA和split crRNA之间的竞争反应可以提高CRISPR-Cas12a的检测灵敏度;(ii) Cas12a可以识别与crRNA互补的片段化RNA/DNA靶标，从而可以直接检测RNA。作者开发了一种用于核酸级联信号扩增检测的非对称CRISPR检测方法，并将其应用于临床肿瘤样本中定量检测miRNA，无需预扩增或逆转录。作者设计了split crRNA，靶向miRNA被选择性检测，LOD为856 aM(比无split crRNA的CRISPR检测灵敏度高1000倍)。本方法采用一种CRISPR酶单管一步等温信号扩增方法，对核酸的检测简单、灵敏、定量。此外，非对称CRISPR具有成本效益，每次检测的材料成本估计低至0.47美元。

尽管取得了令人鼓舞的结果，但在未来的研究中，不对称CRISPR检测可以从几个方面进一步扩展和改进，从而在资源有限的环境中实现即时检测。首先，为了简化人工操作，该分析可以进一步集成到微流控平台中，以实现自动样品制备和液体操作。其次，为了提高检测的单核苷酸序列辨别能力，可以利用和优化新设计的CRISPR酶和设计的crRNA。第三，为了消除对昂贵的荧光检测设备的需求，可以开发一种简单实惠的智能手机检测器，用于荧光记录和信号处理。总的来说，本研究突出了CRISPR-Cas12a反应系统的发现，为早期癌症诊断和传染病检测提供了一种强大的核酸检测方法，具有临床应用潜力。