这次新型冠状病毒如何被发现的？mNGS首功！

最新的新型冠状病毒是如何被发现的？宏基因组测序（mNGS）首当其功！当年SARS，怀疑过支原体、细菌、病毒等感染，最后折腾了很久下才发现是冠状病毒感染。如今mNGS问世，改变了病原微生物学的诊断新格局！这次从发病到诊断，只有短短几天时间！下面就简单介绍一下mNGS.

最近三十年，组学研究一直是热点，最早是基因组学，然后是蛋白质组学，如今新兴组学领域则是被认为最有前景的宏基因组学（Metagenomics）。宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学，通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA或RNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成、群落功能，并可开发新的生理活性物质（或获得新基因）。

2014年新英格兰医学杂志报道了一个通过宏基因组辅助检测治愈了一位原因不明、反复发热、具有癫痫及脑积水症状的14岁男孩的案例，这是历史上首个宏基因组临床应用成功的案例。文章报道这个常规治疗及病原筛查都没有确诊原因，随后对脑脊液样本mNGS筛查，结合生物信息学分析结果发现一种可疑的致病菌leptospira infection，随后针对性地使用万古霉素和头孢吡肟治疗后出院。该团队确认这是一种尚未报道过的病原微生物。由此，临床宏基因组正式应用于微生物诊断拉开了帷幕。详细见：NEJM：新一代测序技术挽救危重病男孩

随着基因测序技术的迅猛发展，基于二代测序的宏基因组学（宏基因组测序）成为了临床的焦点。宏基因组测序（mNGS）是综合分析来自患者样本的微生物和宿主的基因物质（DNA和RNA）的方法，应用于多种感染性疾病的诊断、疾病和健康状态下微生物学分析、人类宿主反应对感染传播的特征化、识别肿瘤相关病毒。宏基因组测序（mNGS）描述了样本中存在的所有DNA或RNA信息，从而能够分析整个微生物组以及患者样本中的人类宿主基因组或转录组，让致病微生物无所遁形。

在临床感染性病原体探寻的过程中，临床医生时常会面对新发病原体往往想不到、疑难感染病原体没想到、或者由于检测技术受限想到没检测到的困境，现有的临床辅助诊断方式与临床的迫切需求之间还存在着巨大的鸿沟。而mNGS (宏基因组学二代测序技术) 在“理论上”能够回答临床医生的上述疑问，现阶段已解决临床感染性疾病诊治的部分困难。

mNGS作为一种不需培养的新型技术，可以深入快速鉴定感染病原体，相比传统培养方法拥有更高敏感性的同时又与“精准诊疗”的理念相契合。Gyarmati 等在2016年发表的一篇文献中指出，mNGS可以直接从血液样本中鉴定不能培养的、苛养的以及非细菌 (病毒和真菌) 病原体。除此之外，mNGS可以用于传染病预防，具有直接从临床样本中获的病原体传播线索的潜力。2014年，Hasman等指出mNGS可用于尿液样本中病原体以及耐药基因的检测，而且不仅耐药基因的检测结果与药敏实验一致，也与基于纯培养物的全基因组测序 (WGS) 的进化分析结果相匹配。越来越多的案例以及临床研究指出mNGS用于临床诊断的可行性以及诸多优势，使得mNGS成为理想病原体诊断方法的“热门候选人”。

mNGS有哪些用途呢？

下面这张图很好地概括和说明了。二代测序不仅可以用于病原学检测，也可以在病原培养后做深度的二代测序，甚至全基因组分析。现在主要用于临床的还是临床标本病原学检测，通过检测可以知道标本中含有的病原体。如果测序量能够进一步突破，它除了可以把标本中里所有微生物的核酸测出来外，也可以把人体表达的所有RNA测出来，帮助判断定植或者感染。比如铜绿假单胞菌测出来后，人体有没有针对它产生炎症反应，还可以判断是定植还是感染，但目前还在探索阶段，尚常规未用于临床。

对于混合感染，mNGS也有天然的优势

对于混合感染的诊断，与传统方法相比，NGS具有更高的敏感性。

然而，在踏上光明坦途，为临床提供“一站式”解决方案之前，mNGS仍有一段崎岖小路需艰难前行。首先，面对血液、痰液、脑脊液、组织、拭子等纷纷杂杂的标本类型，如何建立统一的核酸提取标准使得病原体的检测效能最大化困难重重。宿主核酸也是干扰病原体检测的一大因素，在核酸提取环节，怎么样做到有效去除宿主核酸，富集病原体核酸，进而提高mNGS的灵敏度也是困扰之一。

在测序环节，如何依据关注的病原体类型选择合适的测序策略？如何权衡测序深度、交付时间以及所需经济成本等诸多因素？这些问题依然是现阶段面临的巨大的挑战。

另外，在实验环节加入质控样本不可或缺。理想的质控应适用于不同感染症候群以及对应的各种样本类型，涵盖阳性质控、阴性质控以及加入病原菌或纯DNA的人工模拟质控样本。然而，mNGS全面覆盖的方法学特性为选取何种病原菌作为阳性质控增加了难度，临床实践中又该如何获取经过伦理审批的大批量阴性对照样本也是问题之一。

在生物信息方面，近来有研究评估了不同的生信分析方法的优劣。现有的方法不仅算法存在差异，而且所用的数据库也各有不同，导致在病原体鉴定能力以及相对丰度计算方面出现差别。在mNGS生信分析流程缺乏统一标准的情况下，使用者基于个人经验、可及性以及简便性选用生信分析软件，会对实验重复性以及结果可靠性造成影响，成为mNGS的临床标准化障碍。

因此，该研究重点关注核酸提取和生物信息分析两个重要环节，对比评估三个人源宿主去除试剂盒 (Ultra-Deep Microbiome Prep 、QIAamp DNA Microbiome Kit、Micro-DXTM) 以及多种现有商用或非商用生物信息工具的优劣。

研究者采集9个体液 (腹膜液、脓液、关节液、痰液) 样本和1个骨组织标本进行测序，之后分别使用不同的生物信息软件比如基于Unix系统 (Kraken、Metaphlan2和MIDAS)、基于网页版的商用或非商用 (BaseSpace、Taxonomer和CosmosID) 分析软件与商用工作站 (CLC genomics Workbench)。他们发现不同样本的下机数据量及人源序列占比差异较大 (3.5%-98.9%)，其中人源占比与样本类型无关，与每个样本自身的特性以及去宿主试剂盒的效率有关。

本文章涉及的mNGS生信分析软件

以培养或MALDI-TOF为金标准，研究者评估计算了每种分析软件的病原体鉴定个数以及其对应的阳性、假阳性、敏感性等参数。在临床实践中，新技术需要同时具备具有高敏感性和高阳性预测值 (PPV)。使用Kraken和Taxonomer这两个流行的软件可以看到其检测到数十到数百种微生物，计算获得的PPV极低。虽然设置阈值过滤对解决这一问题有益，但阈值究竟设置为多少仍存在争论。另外，软件需综合使用多个参数，如相对丰度、基因组大小、基因组覆盖率等辅助病原菌的鉴定。

研究者也在阴性质控样本中检出1%的人苍白杆菌，他们分析苍白杆菌的检出可能是环境或样本间的污染、测序试剂引入或生物信息分析的模糊比对等原因导致。背景菌的问题也在多个研究中被提及，这些检出的病原体在样本中是否真实存在？污染、定植还是致病如何区分？技术研发人员，生物信息人员、微生物专家以及临床医生也面临着不断升级的挑战。总结说来，目前mNGS的临床应用面临如下四个挑战：

面对如上的挑战，我们也遇到了一系列的疑问。编者本期搜集了两个关于mNGS临床专家常会问到的问题，从现阶段技术发展的角度出发，给出如下的尝试性解答。

为什么有些样本培养阳性了、核酸检测阳性了、mNGS没有检出来？这个技术是不是不行？

任何临床检测都要考虑卫生经济成本，这也是新技术mNGS的考量因素之一，使得目前mNGS经济成本与灵敏度之间需要权衡。临床样本具有相当高的复杂性，而且很多病原体感染后含量很低或用药后取样导致病原数量降低，在限定数据量的情况下，靶病原由于信息太少而被丢失。

由于这些挑战带来的检测局限，往往就会促使临床医生形成认识局限，所以我们听到临床医生对mNGS功能的不认可的声音。虽然扩大数据量是手段之一，但在卫生经济成本的限定下总有限度。通过富集病原菌，加大测序数据量，进而提高灵敏度；检测长片段，进而提高特异性是我们与临床目前以及未来共同努力的方向。

临床医生经常反馈mNGS检测结果是一个病原体列表，到底哪个或哪几个病原才是元凶？

多个病原的检出主要如下两个方面原因：

mNGS技术算法存在短序列模糊比对，尤其针对部分同源性较高的物种，因此其在这类同源性较高的物种中分类意义就打了折扣。如何解决一个短序列同时比较到多种病原体问题呢？目前我们的研发人员正在快速的开发特征基因数据库，多个数据库的启用将会进一步提高病原菌的准确比对能力。

多病原共感染、 原发感染与继发感染的多病原感染或呼吸道分泌物，肠道分泌物开放体系本身的微生物多样性等原因将会导致多种病原体检出。这实际上不是技术本身局限，而是临床医学问题。培养方法、质谱方法、多重PCR方法也会检出多个病原体，最终的诊断结论需要有临床诊断的相关信息介入、也需要临床感染医生的共同参与，不能仅靠检测解决一切问题。在充分精简报告的情况下，多病原体列表展示的优势作用在于一方面提供可能的有效线索，另一方面当有准确清晰的临床信息时可以辅助临床诊断。

对于mNGS来说，可以说为病原学诊断又打开了一扇新的窗户，我们一定要大胆的实践，要了解它的优势和缺点，但是拿到结果时要小心求证，掌握新前沿。

原始出处：

Couto, N., Schuele, L., Raangs, E. C., Machado, M. P., Mendes, C. I., Jesus, T. F., ... & Autenrieth, I. B. (2018). Critical steps in clinical shotgun metagenomics for the concomitant detection and typing of microbial pathogens. Scientific reports, 8(1), 13767.

Gyarmati, P. et al. Metagenomic analysis of bloodstream infections in patients with acute leukemia and therapy-induced

neutropenia. Sci. Rep. 6, 23532 (2016).

Hasman, H. et al. Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical

Chu JT, Hossain R, Silverblatt FJ, Hyle EP, Turbett SE. Case 22-2017. A 21-Year-Old Woman with Fever, Headache, and Myalgias. N Engl J Med. 2017 Jul 20;377(3):268-278.